Za prvé, oba EcoR1 a Xba1 zanechávají 5' přesahy, když tráví DNA (stejně jako Nde1). V obou případech je 3' konec zapuštěný, proto může polyermase přidat báze. Za druhé, všechny polymerázy mohou přidávat báze pouze na 3' konec, takže Klenow přidá 4 báze na ustupující 3' konec obou míst, aby vytvořil tupé konce.
Zanechávají restrikční enzymy 5 fosfátů?
Vektory a inserty štěpené restrikčními enzymy obsahují nezbytné koncové modifikace (5' fosfát a 3' hydroxyl), zatímco fragmenty vytvořené polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) nemusí.
Lze podvázat tupé konce?
Podvázání tupého konce
Podvázání tupého konce nezahrnuje párování bází vyčnívajících konců, takže jakýkoli tupý konec může být podvázán s jiným tupým koncem. Tupé konce mohou být generovány restrikčními enzymy, jako jsou Smal a EcoRV.
Vytváří Taq polymeráza tupé konce?
Yes… Taq Polymerase přidá A-Přesahy, pokud ponecháte konečný krok prodloužení na 72 dC na PCR. Většinou se používá pro klonování TA.
Proč používat Klenowův fragment při sekvenování DNA?
Klenowův fragment je mimořádně užitečný pro výzkumné úkoly, jako jsou: Syntéza dvouvláknové DNA z jednovláknových templátů . Vyplnění ustupujících 3' konců DNA fragmentů tak, aby 5' převis byl tupý . Odbourávání vyčnívajících 3' převisů.
